醫(yī)療器械創(chuàng)新網(wǎng)
與行業(yè)里的那些膾炙人口的DNA聚合酶、RNA聚合酶等相比，蛋白酶K顯得很低調(diào)，以至于我們長(zhǎng)期忽視了它的重要性。隨著這次新冠疫情的爆發(fā)，蛋白酶K的需求量暴增，國(guó)內(nèi)外的供應(yīng)量遠(yuǎn)跟不上消耗量，大家才突然意識(shí)到蛋白酶K是如此的重要。
蛋白酶K / 是什么？
蛋白酶K(Proteinase K)，屬絲氨酸蛋白酶類，1974年，Wolfgang Ebeling等利用沉淀、離子交換層析和凝聚層析等方法在林伯氏白色念球菌的培養(yǎng)基中分離純化出蛋白酶K。因能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)為唯一碳氮源的環(huán)境中生長(zhǎng)，即能夠消化角蛋白，因此被命名為蛋白酶K(Proteinase K)。蛋白酶K由一條肽鏈組成，包含277個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為28.9kDa。蛋白酶K家族包含了各種由真菌、酵母及革蘭氏陰性細(xì)菌分泌的細(xì)胞內(nèi)肽酶。
蛋白酶K具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)、極高的酶活力和廣泛的底物特異性，但偏好于帶有脂肪族及芳香烴的肽鏈，能優(yōu)先分解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端連接的肽鍵。與其它的蛋白酶相比較，蛋白酶K具有高活力和高穩(wěn)定性，其酶活不會(huì)被尿素、SDS和EDTA等變性劑抑制，且在高溫、高鹽或較高的pH等條件下，蛋白酶K仍能保持較高活性。因該酶在較廣的pH范圍(4～12.5)內(nèi)及高溫(50～70℃)均有活性，在提取DNA和RNA的緩沖液中具有很高的活性，可用于質(zhì)?；蚧蚪MDNA、RNA的分離，是DNA提取的關(guān)鍵試劑。
蛋白酶 K 是現(xiàn)有蛋白酶中活性最高的品種，在 pH 4 到 pH 12 的條件下均有活性，反應(yīng)溫度介于 0～75oC 之間。在常用濃度的 SDS、尿素或 EDTA 存在時(shí)亦很穩(wěn)定。酶切割位點(diǎn)在脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，可以用于所有蛋白質(zhì)的降解。
蛋白酶K /國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）是2018年5月1日實(shí)施的一項(xiàng)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，歸口于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院?！兜鞍酌窴》（GB/T 34793-2017）規(guī)定了蛋白酶K產(chǎn)品的術(shù)語(yǔ)和定義、技術(shù)要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸及貯存?！兜鞍酌窴》（GB/T 34793-2017）適用于生化試劑蛋白酶K產(chǎn)品的生產(chǎn)和檢測(cè)。
蛋白酶K /有什么作用？
近年來，隨著研究的深入，蛋白酶K的應(yīng)用不僅僅局限在醫(yī)療診斷及科研領(lǐng)域。在實(shí)現(xiàn)規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的前提下，蛋白酶K還可以替代作用范圍較窄的其它蛋白酶，應(yīng)用于工業(yè)制革、食品加工、飼料生產(chǎn)、造紙等行業(yè)中。另外，蛋白酶K也可以替代傳統(tǒng)的可能存在污染的化學(xué)方法處理原材料，去除不必要的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。蛋白酶K目前主要應(yīng)用于基因診斷試劑盒、基因組 DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒中去除核酸酶和其它蛋白污染。
對(duì)于新冠病毒，核酸擴(kuò)增試驗(yàn)時(shí)的處理、抽提、擴(kuò)增為高風(fēng)險(xiǎn)，因此擴(kuò)增前需要對(duì)標(biāo)本先行滅活病毒，蛋白酶K(Proteinase K)是病毒采樣液的重要組分，可裂解病毒釋放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。并且可以滅活病毒，讓病毒的蛋白變性，失去活性而“死掉”，不再有傳染性，提高運(yùn)輸和檢測(cè)階段的安全性。
蛋白酶K能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離，在提取高分子量核酸時(shí)有很大的優(yōu)勢(shì)。蛋白酶K還常被用于RNA提取過程中RNase的抑制和降解。RNA的質(zhì)量對(duì)于Northem印跡及雜交分析、cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要。而RNA極不穩(wěn)定、易于被廣泛存在的RNase降解，因此利用蛋白酶創(chuàng)造一個(gè)無RNase的環(huán)境、嚴(yán)格防止RNase污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。
蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前標(biāo)本的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，以利于檢測(cè)探針的穿透，提高檢測(cè)的敏感性。
病毒外層結(jié)構(gòu)一般以衣殼蛋白為主，蛋白酶K可以對(duì)病毒衣殼蛋白進(jìn)行破壞，從而干擾病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合。在一定條件下，67.51ug/mL濃度的蛋白酶K處理lh對(duì)純水和生活污水中病毒滅活率分別達(dá)到了99.4％和49.4％，處理3h的滅活率分別是>99.9％和81.8％，滅活病毒的效果明顯。用蛋白酶K進(jìn)行病毒滅活的優(yōu)點(diǎn)是消毒劑本身無害，而且不產(chǎn)生有害消毒產(chǎn)物，所以這是一種高效環(huán)保的方法。
病毒外層結(jié)構(gòu)一般以衣殼蛋白為主，蛋白酶K可以對(duì)病毒衣殼蛋白進(jìn)行破壞，從而干擾病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合。在一定條件下，67.51ug/mL濃度的蛋白酶K處理lh對(duì)純水和生活污水中病毒滅活率分別達(dá)到了99.4％和49.4％，處理3h的滅活率分別是>99.9％和81.8％，滅活病毒的效果明顯。用蛋白酶K進(jìn)行病毒滅活的優(yōu)點(diǎn)是消毒劑本身無害，而且不產(chǎn)生有害消毒產(chǎn)物，所以這是一種高效環(huán)保的方法。
蛋白酶K能分解肉的肌纖維，結(jié)締組織的蛋白質(zhì)，甚至包括彈性蛋白及膠原蛋白，使蛋白質(zhì)的各級(jí)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，部分肽鍵斷裂，肉料吸水膨脹，質(zhì)地變嫩，滿足消費(fèi)者對(duì)肉類品質(zhì)的要求。
蛋白酶K /是金子總會(huì)發(fā)光！
不管是在科研領(lǐng)域，還是在IVD領(lǐng)域，核酸提取都是最為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，因而蛋白酶K一直都是非常重要的存在。然而過去，蛋白酶K的知名度遠(yuǎn)不及它所發(fā)揮的作用，這其中很大一部分原因是因?yàn)榈鞍酌窴的供需關(guān)系非常穩(wěn)定，很少有人會(huì)認(rèn)為蛋白酶K的供給會(huì)是一個(gè)問題。
全球新冠肺炎感染人數(shù)不斷創(chuàng)新高，新冠病毒傳染性增強(qiáng)對(duì)疫情的防控?zé)o疑是產(chǎn)生更大的挑戰(zhàn)，對(duì)新冠核酸檢測(cè)的需求也不斷提升，蛋白酶K作為核酸檢測(cè)試劑盒中用于檢測(cè)樣本前處理的重要組分，目前市場(chǎng)需求也不斷加大。
在核酸提取實(shí)驗(yàn)中蛋白酶K的工作濃度大約是50-200 μg/mL，一般情況下，提取一個(gè)樣本的核酸大約需要100 μg的蛋白酶K?，而在實(shí)際使用過程中，為了增加核酸提取效率，經(jīng)常會(huì)將蛋白酶K加量使用。新冠病毒的核酸檢測(cè)帶來了大量的蛋白酶K需求，蛋白酶K原有的供需平衡被迅速打破，蛋白酶K一夜之間成為了重要的防疫物資。
蛋白酶K /大規(guī)模生產(chǎn)難點(diǎn)
雖然隨著疫情的發(fā)展，蛋白酶K的重要價(jià)值被人們所重視，然而尷尬的是，由于蛋白酶K的過度低調(diào)，以至于國(guó)內(nèi)很少有企業(yè)涉獵過蛋白酶K的生產(chǎn)，當(dāng)人們想建立蛋白酶K的生產(chǎn)工藝時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)蛋白酶K是一個(gè)極其特殊的蛋白，短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)大蛋白酶K的產(chǎn)能極具挑戰(zhàn)性。
表達(dá)量低
蛋白酶K能夠非特異性的降解大多數(shù)蛋白，對(duì)于表達(dá)宿主細(xì)胞造成嚴(yán)重毒性，因此蛋白酶K的表達(dá)量一般都很低。篩選高表達(dá)蛋白酶K的表達(dá)系統(tǒng)和菌株，一般需要較長(zhǎng)的周期。
色素和核酸的殘留
大規(guī)模發(fā)酵，引入大量色素和宿主核酸的殘留，簡(jiǎn)單的純化工藝很難除去這些雜質(zhì)，而復(fù)雜的純化又增加了成本和降低了回收率。
不穩(wěn)定性
蛋白酶K不夠穩(wěn)定，自己能酶解自己，在無保護(hù)劑時(shí)，37℃很難長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。
易沉淀
在制備蛋白酶K的凍干粉時(shí)，為了保證凍干粉中蛋白酶K的固含量較大，需要在高濃度時(shí)加入凍干保護(hù)劑，但是蛋白酶K在濃度達(dá)到20mg/mL及以上時(shí)，很容易聚集形成沉淀，這給蛋白酶K的高固含量?jī)龈蓭砗艽蟮睦щy。
投入大
蛋白酶K具有很強(qiáng)的蛋白酶活性，能夠?qū)?shí)驗(yàn)室的其它蛋白酶解，所以蛋白酶K需要專門的產(chǎn)地、儀器設(shè)備、人員來進(jìn)行研發(fā)與生產(chǎn)。
蛋白酶K在體外診斷、藥物加工等生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著不可替代的重要作用。長(zhǎng)期以來，我國(guó)實(shí)驗(yàn)室所用的蛋白酶K都是從各級(jí)代理商中買到的進(jìn)口產(chǎn)品，下游產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重依賴進(jìn)口。隨著新冠疫情的全球大流行，蛋白酶K供不應(yīng)求，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)嚴(yán)重缺貨，“卡脖子”效應(yīng)明顯。為了不受制于人，降低成本，國(guó)產(chǎn)蛋白酶K替代進(jìn)口將成必然趨勢(shì)。
