最近很多一線實驗室的PCR人反饋：“內標半數不起”、“內標曲線Ct值偏大”、“內標時期時不起”......很是困擾。針對這個想象，小六依據多年實踐工作經驗及異常曲線問題處理經驗，與大家分享“內標曲線異常”的處理思路。

首先，確認擴增曲線分析設置是否正確

查看是否設置了合適的基線和閾值線。

其次，確認內標的類型

我們知道，新冠病毒核酸檢測試劑盒的內對照分為：內源性內標和外源性內標。

內源性內標，常采用的是樣本中固有的人體細胞中的管家基因，如RNase P等人源基因，這些基因在人體各器官組織細胞中普遍存在，存在于采集的咽拭子等標本中，因此可以檢測是否采集到了上皮細胞及整個實驗操作過程的準確性，由于人基因組和病毒提取效率存在一定差別，內源性內標無法完全監測提取過程中存在的問題。

外源性內標，常用的是MS2噬菌體等假病毒，在臨床標本制備前加入，然后與標本中的靶核酸一起經歷核酸提取過程，可以較全面地監測從核酸提取到產物分析全過程的有效性。外源性內標不但可以監測標本中PCR抑制物及核酸提取中試劑的混入所致的假陰性外，而且還可以監測因為PCR擴增儀孔位間溫度的不準確及核酸的提取效率太低所致的假陰性。

與內源性人源基因相比，外源性內對照不能監控標本采集的質量，需要提前制備并作為試劑盒的一個組分。

1.如果實驗室使用的試劑盒為內源性內標

內源性內標，為人體細胞中的管家基因，監測的是樣本采集及提取、擴增全過程。

內源性內標不起線或者Ct值偏大，考慮因素：

①標本采集方面：

標本是環境/物體標本or人源標本？

→環境/物表標本：標本中正常無人源性內標

→人源標本：標本中采集到的細胞數量是否足夠

②若人員標本，除考慮采樣中細胞數量是否足夠外，還用考慮標本提取效率和擴增效率。

→提取效率：采用磁珠法進行核酸提取的標本，提取過程中會因為標本中干擾物質多或者提取儀問題導致提取后的核酸樣本中含有抑制物。

例如，標本中含有較多粘液或者血液時樣本裂解不充分，或者，提取儀問題導致提取后的核酸中有殘留的磁珠等，都會抑制后續的擴增反應。

還有可能，因為添加蛋白酶K的核酸提取體系與后續核酸擴增的試劑之間有抑制。（這類問題有案例，提取樣本時添加蛋白酶K后擴增發現內標不起或者Ct值偏大；待復檢時不加蛋白酶K提取樣本后擴增內標正常。這類情況只局限于幾家廠家的擴增試劑，因此，實驗室在開展新冠病毒核酸檢測前一定要對實驗室的檢測系統進行性能驗證。）

→擴增效率：擴增效率受八連管/96孔板和qPCR儀狀態影響。八連管/96孔板不潔凈會抑制擴增，影響擴增效率；qPCR儀孔間溫度不均會影響擴增效率，或者，孔內有灰塵等影響熒光值。

2.如果實驗室使用的試劑盒為外源性內標

外源性內標，為假病毒，在樣本提取核酸前加入，然后與樣本中的靶核酸一起經歷核酸提取過程，可以較全面地監測從核酸提取到產物分析全過程的有效性。不但可以監測樣本中PCR抑制物及核酸提取中試劑的混入所致的假陰性外，還可以監測因為qPCR儀擴增孔位間溫度的不準確及核酸的提取效率太低所致的假陰性。

因此，如果樣本間提取效率和擴增效率的一致性較好，則內標的Ct值應相近。

外源性內標不起線或者Ct值偏大，考慮因素：提取效率和擴增效率。（與內源性內標分析原因一致）

附：“內標曲線異常”處理思路圖